Ensayo de desplazamiento térmico de GFP para el cribado de interacciones entre ligandos y lípidos con transportadores de solutos

Los transportadores del servicio de solutos (SLC) simbolizan la segunda fracción más grande del proteoma de membrana después de los receptores acoplados a proteínas G, sin embargo han sido infrautilizados como dianas farmacológicas y el funcionamiento de muchos miembros de esta familia sigue siendo desconocido.

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Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002 Cusabio
Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002-100ug Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
9-00003 Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
9-00003 Biotium

Técnicamente es difícil trabajar con ellas, ya que son difíciles de precisar y extremadamente dinámicas, lo que las hace inestables en la resolución con detergentes. Muchas SLC carecen de inhibidores reconocidos que puedan utilizarse para su estabilización. Además, como se unen a sus sustratos fisiológicos con afinidades de micromolar excesiva a milimolar baja, los ensayos de unión y transporte han demostrado ser notablemente difíciles de implementar.

nycodenz medium
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Anteriormente, informamos de una técnica basada en GFP para la sobreexpresión y purificación de proteínas de membrana en Saccharomyces cerevisiae. Aquí mismo, prolongamos esta plataforma de expresión con el ensayo de desplazamiento térmico de GFP (GFP-TS), que es un modelo simplificado de cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia que mezcla la versatilidad del patrón de cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia con la funcionalidad de alto rendimiento de los ensayos de desplazamiento térmico basados en colorantes.

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ELISA-1 Alpha Diagnostics
Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit
LF-EK60047 Abfrontier

Revelamos cómo la GFP-TS puede utilizarse para detectar interacciones ligando particulares de fusiones de transportadores SLC y medir sus afinidades en membranas crudas solubilizadas con detergente. Además, presentamos cómo GFP-TS podría ser empleado en purificado SLC transportador fusiones para mostrar la pantalla para determinadas interacciones lípido-proteína, que es un complemento vital a los enfoques nativos de espectrometría de masas que no pueden hacer frente simplemente con crudo lípido-preparaciones de mezcla.

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Este protocolo es fácil de llevar a cabo y podría ser adoptado por los investigadores con un fondo fundamental en la química de proteínas. A partir de un transportador SLC montar que puede ser expresado y purificado a partir de S. cerevisiae en un estado bien plegada, esta extensión del protocolo podría llevarse a cabo en ~ 4-5 d.

Ensayos de unión basados en la termoestabilidad revelan una interacción avanzada de unión de cationes, sustratos y lípidos en el transportador bacteriano DASS, VcINDY
La divalente aniones simportador de sodio (DASS) de la familia de los transportadores (SLC13 familia en las personas) son reguladores clave de la homeostasis metabólica, la interrupción de lo que termina en la seguridad de la diabetes y los problemas de peso, y la inhibición de la proliferación de células de cáncer de hígado más.


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ELISA-1
Frit Kit
FRIT-KIT
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Por lo tanto, los inhibidores del transportador DASS son objetivos atractivos en la terapia de enfermedades metabólicas persistentes relacionadas con la edad. La caracterización de una serie de transportadores DASS ha revelado variación dentro de la selectividad del sustrato y la flexibilidad dentro del ion de acoplamiento utilizado para el transporte de energía.

Aquí, utilizando el maniquí DASS co-transportador, VcINDY de Vibrio cholerae, hemos examinado la interacción de las tres principales interacciones que ocurren a lo largo de transporte: el ion de acoplamiento, el sustrato, y la atmósfera de lípidos.


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Alpha Diagnostics
Frit Kit
Next Advance
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Next Advance

Utilizando una colección de alto rendimiento termoestabilidad basada en ensayos de interacción, hemos demostrado que la unión del sustrato es dependiente de Na +; un requisito que es orquestada por medio de una mezcla de atracción electrostática y Na + inducida por el cebado de la estructura del sitio web de unión.

Ahora hemos reconocido nuevos ligandos DASS y reveló que la unión del ligando está dominada por el requisito de dos equipos de carboxilato dentro del ligando que están exactamente distanciados para cumplir con las áreas de interacción de carboxilato del sitio web de unión del sustrato. Ahora hemos reconocido, además, una relación elegante entre el sustrato y las interacciones de lípidos, lo que sugiere una posición dinámica y reguladora de los lípidos en el ciclo de transporte de VcINDY.

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Alpha Diagnostics
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Ensayo de flotación de liposomas para conocer las interacciones entre las partículas del virus de la rubéola y las membranas lipídicas

El virus de la rubéola (RuV) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo con envoltura que es patógeno para las personas. RuV se une a la célula diana a través de la proteína de la envoltura viral E1, sin embargo las moléculas receptoras particulares en la célula diana son, pero para ser totalmente dilucidado.

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ELISA-1 Alpha Diagnostics
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LF-EK60047 Abfrontier
Chicken thrombomodulin,TM ELISA KIT ELISA
QY-E80092 Qayee Biotechnology
Oxycodone ELISA
EK7130 BosterBio
Amphiphysin ELISA
LF-EK0189 Abfrontier
Nycodenz, 500 grams
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ELISA-1
Frit Kit
FRIT-KIT
Column Packing Kit
PACK-KIT

Aquí describimos un protocolo de ensayo de flotación de liposomas para comprobar las interacciones directas entre las partículas de RuV y las membranas lipídicas en un método cualitativo. Las interacciones son examinados por un fraccionamiento en gradiente de densidad Nycodenz utilizando partículas RuV UV-inactivado y liposomas marcados con fluorescencia que consiste en lípidos puros.

100 BP DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-100BP CORNING
1 KB DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-1KB CORNING
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.1 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.25 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-5 ApexBio

Las partículas de RuV fraccionadas se detectan mediante electroforesis normal en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida de evaluación Western blot para proteínas virales. En el gradiente Axis Shield Nycodenz, las partículas de RuV unidas a liposomas se desplazan a fracciones de menor densidad que las partículas de RuV no unidas.

Utilizando este protocolo, ofrecemos pruebas convincentes de que, a pH imparcial en un método dependiente del calcio, las partículas RuV se unen a las membranas lipídicas que contienen cada esfingomielina (SM) y el colesterol ldl en los tipos de células seguras.

Paraffin Wax Dispenser
Scientific Laboratory Supplies
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
MagSi-WAX
Magtivio
MagSi-WAX
Magtivio

Detección de IgM salmónida particular a la proteína Sigma 1 de la espiga de la cápside externa del ortoreovirus de los peces utilizando antígenos modificados con lípidos en un ensayo de detección de anticuerpos basado principalmente en microesferas.

Los inmunoensayos multiplex basados en microesferas son instrumentos prometedores para la dedicación de la respuesta inmunitaria humoral particular. En este estudio, desarrollamos un inmunoensayo multiplexado basado en microesferas para la detección de anticuerpos del salmón del Atlántico (Salmo salar) contra el ortoreovirus de los peces (PRV).

Protein A protein
Fitzgerald
pLDH Protein Protein
Abbexa
pLDH Protein Protein
Abbexa
The GFP thermal shift assay for screening ligand and lipid interactions to solute carrier transporters
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Amphiphysin ELISA
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Tres genotipos completamente diferentes de PRV (PRV-1, PRV-2 y PRV-3) desencadenan enfermedades en salmónidos de piscifactoría. Se predice que la proteína σ1 de la cápside externa del PRV es una proteína de unión a receptores de bunch y un objetivo para los anticuerpos neutralizantes y protectores.

Mientras que la σ1 recombinante funcionó mal como antígeno para detectar anticuerpos particulares, la modificación lipídica N-terminal de la σ1 recombinante del PRV-1 permitió la detección delicada de IgM particulares dentro del ensayo basado en microesferas. La especificidad de los anticuerpos anti-PRV-1 σ1 se confirmó mediante western blotting y preadsorción de plasma.

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La unión de IgM inespecíficas a microesferas recubiertas con antígenos de gestión también aumentó tras la infección por PRV, lo que indica la aparición de anticuerpos polirreactivos. Esta unión inespecífica se redujo con el tratamiento térmico del plasma. El mismo inmunoensayo detectó además anticuerpos anti-PRV-Three σ1 en truchas arco iris contaminadas.

En resumen, un inmunoensayo refinado basado principalmente en microesferas creado mediante la modificación lipídica N-terminal del antígeno PRV-1 σ1 permitió la detección delicada de anticuerpos anti-PRV-1 y anti-PRV-Three de salmónidos.

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Alpha-bungarotoxin, CF680r
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Reconstitución asistida por detergente de atlastina recombinante de Drosophila en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos.


La fusión de membranas es un proceso importante dentro de la célula eucariota. Las proteínas especializadas son esenciales para catalizar la fusión. Las atlastinas son proteínas residentes del retículo endoplásmico (RE) implicadas en la fusión homotípica del RE. Aquí presentamos un método para purificar una atlastina de Drosophila marcada con glutatión S-transferasa (GST) y poli-histidina mediante dos rondas de cromatografía de afinidad.

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
Bioingentech
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
Bioingentech
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
Bioingentech
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ranavirus PCR kit
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El aprendizaje de las reacciones de fusión in vitro requiere que las proteínas de fusión purificadas se inserten directamente en una bicapa lipídica. Los liposomas son membranas maniquí espléndidas, ya que la composición lipídica y la dimensión también podrían ajustarse. Con este fin, describimos una técnica de reconstitución por eliminación de detergentes para la atlastina de Drosophila en liposomas preformados.

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Mientras que una serie de estrategias de reconstitución se puede encontrar, la reconstitución por eliminación de detergente tiene una serie de beneficios que lo hacen apropiado para atlastins y diferentes proteínas comparables. La ventaja de esta técnica es un rendimiento de reconstitución excesivo y una orientación adecuada de la proteína reconstituida.

Esta técnica podría prolongarse a diferentes proteínas de membrana y para diferentes propósitos que requieran proteoliposomas. Además, describimos un ensayo de mezcla de lípidos basado principalmente en FRET de proteoliposomas utilizado como medida de la fusión de membranas.

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Fuentes :

  1. Gentaur
  2. NCBI

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